“发汗”是道地药材产区传统加工炮制技术之一，是产地初加工长期生产实践和经验积累的智慧结晶。即将新鲜药材稍加热或部分干燥后，堆积发热，使其内部水分向外蒸发，凝成水珠附于药材表面，如出汗，故称为“发汗”[1]。研究表明，“发汗”加工可使药材内部水分重新分布，加快干燥速度；促进药效成分的生物与化学转化；改善药材外观、质地、气味、药性等，进而影响药理作用等[2-5]。随着温、湿度变化，“发汗”过程中药材的微生物群落结构和多样性也发生变化，进而改变药效成分及药理作用[6-10]。
丹参为唇形科丹参属植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈之功[11]。丹参“发汗”后，药材条直，表面呈暗红棕色，断面变紫，目前，中江丹参道地产区仍有沿用“发汗”加工法的传统，明代李时珍认为“丹参，其根皮丹而肉紫”[12]，而中江丹参经“发汗”处理断面多为棕褐色或紫褐色，通常被认为是质量上乘的性状指标[13-15]。目前，关于中药“发汗”过程中微生物群落结构特征及其对药效成分影响的相关研究较少。因此，本研究采用高通量扩增测序技术，探索“发汗”过程中江丹参药材的微生物群落特征及变化规律，并结合化学品质分析，深入探究优势微生物群落与中江丹参药效成分之间的相关性，旨在寻找影响中江丹参药材品质相关的优势微生物群落，为中江丹参“发汗”这一特色产地加工技术的科学内涵提供理论依据。
Analytik Jena-q Tower 2.2 型荧光定量 PCR 仪，德国 Analytik Jena AG 公司； Agilent 1260 型高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司； Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ）； XS205 型电子分析天平，十万分之一，瑞士 Mettler Toledo 股份有限公司； KQ2200 型清洗器，昆山市超声仪器有限公司； DHG-9240 型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司； BSA224S 型电子分析天平，万分之一，德国 Sartouris 股份有限公司； DFY-200 型摇摆式高速万能粉碎机，浙江温岭市林大机械有限公司；药典筛，四号筛， 0.25 μm 孔径，浙江上虞市道墟化验仪器设备厂；微孔滤膜， 0.45 μm 孔径，有机尼龙 66 ，天津市科亿隆实验设备有限公司； c-DNA 提取试剂盒，北京艾德莱生物科技有限公司。
1.2.2 药材及加工处理 丹参样品于 2023 年 2 月采集于四川省德阳市中江县集凤镇小脚坡村（ E104°67′ ， N31°03′ ），选取同一农户、同一地块中江丹参植株若干，除去地上部分，取中江丹参地下根和根茎，趁鲜带回，经四川省中医药科学院李青苗研究员鉴定为唇形科丹参属植物丹参 S. miltiorrhiza Bge. 的根及根茎。通过混样将所有地下根和根茎平均分为 10 份，随机取其中 2 份，设置为实验空白样品，不作任何处理。
本实验以丹参大部分根茎断面变棕褐或紫褐色，作为评定“发汗”结束的标准。模拟中江丹参种植农户的传统“发汗”方式，总计堆置“发汗”时长为 10 d 。设定“发汗”每满 5 d 取样 1 次，第 1 次取样后将样品敞开摊晾 2 d ，再次“发汗” 5 d ，完成第 2 次取样。样品共计 21 个，分别标记为 A （新鲜样品， 0 d ）、 B （第 1 次发汗 5 d ，各样品分别编号 B1 ～ B10 ）、 C （第 2 次发汗 5 d ，各样品分别编号 C1 ～ C10 ）。各样品取后立即存放在 −80 ℃ 低温冰箱中 冷冻，备用。样品信息见表 1 。
中江丹参“发汗”过程中样品的真菌 ITS 区及细菌 V1 ～ V9 区基因测序，由成都丹凤科技有限公司完成。将所有待测样品在无菌条件下用液氮研磨仪研成细粉后，平均分为 3 份，用 c-DNA 提取试剂盒按照试剂盒的使用说明，提取 DNA[16-17] ，用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量。
所有样品的 PCR 产物用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测，参照电泳初步定量结果，对目的条带使用索莱宝公司提供的凝胶回收试剂盒回收产物， PCR 产物用 Analyti Kjena-q TOWER 2.2 型荧光定量 PCR 仪进行检测定量。之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
将测序结果在 LC-Bio 公司提供的 Illumina NovaSeq 平台上进行分析。使用 Pear 合并读取配对端。根据 fqtrim （ v 0.94 ）获得高质量清洁标签的条件。筛选嵌合序列采用 Vsearch 软件（ v 2.3.4 ）。使用 DADA 2 进行去重复后，得到特征表和特征序列。然后选择所有的样品统一按最小样本序列数进行抽平分析，基于抽平后的数据，使用 QIIME 2 软件计算 α 多样性指数与 β 多样性指数分析，采用 R 软件（ v3.5.2 ）绘制分析图片，基于分类学信息，对各个分类水平上的群落结构进行统计分析。
（1）水溶性成分： 取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 对照品，精密称定，加 75% 甲醇制成含丹参素钠 2.42 mg/mL 、迷迭香酸 0.53 mg/mL 、紫草酸 0.34 mg/mL 、丹酚酸 B 0.19 mg/mL 的混合对照品溶液，即得， 4 ℃下保存。
（2）脂溶性成分： 取二氢丹参酮 I 、隐丹参酮、丹参酮 I 、丹参酮 II A 对照品，精密称定，加甲醇制成 含二氢丹参酮 I 0.83 mg/mL 、隐丹参酮 1.75 mg/mL 、丹参酮 I 1.24 mg/mL 、丹参酮 II A 2.48 mg/mL 的混合对照品溶液，即得， 4 ℃下保存。
（1）水溶性成分： 取丹参粉末（过 4 号筛）约 0.25 g ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 75% 甲醇 25 mL ，密塞，称定质量，超声处理（功率 140 W 、频率 42 kHz ） 40 min ，放冷，再称定质量，用 75% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，过 0.45 µm 微孔滤膜，即得水溶性成分供试品溶液。
2.4.4 线性关系考察 精密吸取“ 2.4.1 ”项下对照品溶液 1 、 3 、 5 、 10 、 15 、 17 µL 进样分析，在“ 2.4.3 ”项色谱条件下测定，以对照品溶液含有量为横坐标（ X ），相对峰面积为纵坐标（ Y ）进行线性回归，得回归方程：丹参素钠 Y ＝ 46.275 X － 0.585 3 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；迷迭香酸 Y ＝ 682.740 X － 0.257 7 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；紫草酸 Y ＝ 4 718.20 X ＋ 149.85 ， r ＝ 0.999 9 ， 线 µg ；丹酚酸 B Y ＝ 12 421.0 X ＋ 215.69 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；二氢丹参酮 I Y ＝ 2 365.2 X ＋ 487.74 ， r ＝ 0.999 9 ，线 µg ；隐丹参酮 Y ＝ 2 424.4 X ＋ 2 542.2 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；丹参酮 I Y ＝ 6.031 8 X ＋ 7.171 3 ， r ＝ 0.999 8 ，线 µg ；丹参酮 II A Y ＝ 1 661.10 X ＋ 1 287.50 ， r ＝ 0.999 7 ，线 µg ；结果表明，各成 分在各自质量浓度范围内呈良好的线 高通量测序数据统计及 α 多样性统计 通过对中江丹参“发汗”过程中，不同取样时间点样品进行微生物群落结构和多样性测序分析质控后，线 条有效序列，平均每个样本具有 （ 80 835 ± 41 742 ）条。细菌共 78 666 条有效序列，平均每个样本具有（ 76 770 ± 7 490 ）条。每个样品的覆盖率均在 95% 以上，表明测序深度均已覆盖到测试样品中的大部分物种，具有可靠的数据质量。对于线 样品具有较高的 Shannon 均匀度指数（ 4.99 ），具有较高的 Chao l 指数（ 258.00 ），表明此时真菌群落多样性高；此时真菌物种也最为丰富，说明 9 号样品的发汗条件（室外光照空旷，黑色塑料薄膜覆盖，堆置高度 20 cm ）在发汗时间 5 d 时，真菌的物种总数和种类明显增加，这可能与此“发汗”条件创造的湿热环境适宜药材中内生真菌快速生长繁殖有关。且折线图显示 Chao l 指数估计发汗 10 d 的所有样品真菌群落丰度显著高于其他样品。结果见图 3 。
由图 4 可知，Chaol 指数估计发汗5 d 的样品细菌丰度普遍较大，并显著高于0 、10 d 的样品，说明在“发汗”5 d 左右样本中细菌物种总量最高，群落组成最复杂；此外，8 号发汗条件（室外光照空旷，黑色塑料薄膜覆盖，堆置高度15 cm ）的样品Chao l 指数显著高于其他发汗条件样品。Shannon 均匀度指数显示8 号发汗条件的样品细菌多样性显著高于其他发汗条件样品，并在发汗5 d 时出现最大值（3.38 ），这可能是由于新鲜丹参室外覆膜堆置，加之黑色薄膜聚热较强，为药材表面适合高温生长的细菌创造了活动繁殖的条件。
2.5.2 “发汗”过程中丹参样品微生物群落结构组成及变化规律 将不同“发汗”时间点的微生物根据总的测序结果进行筛选并计。